脱基质型松质骨对成骨细胞内游离钙及碱性磷酸酶水平的影响
【摘要】 目的 研究猪脱蛋白型松质骨(DPB)、脱钙型松质骨(DB)对成骨细胞内游离钙(Ca 2+ )浓度、碱性磷酸酶(ALP)活性的影响，探讨这两种材料的生物相容性。方法 体外分离培养SD乳大鼠颅骨成骨细胞，纯化后与猪脱蛋白型松质骨、脱钙型松质骨复合，培养7天后测定Ca 2+ 浓度、ALP活性。结果 脱钙型松质骨组成骨细胞Ca 2+ 浓度、ALP活性高于脱蛋白型松质骨组及空白组。脱蛋白型松质骨组成骨细胞Ca 2+ 浓度、ALP活性与空白组无明显差异。结论 两种材料对细胞内游离钙浓度及碱性磷酸酶活性无不良影响，脱钙型松质骨对于成骨细胞的合成、分泌有促进作用。游离钙浓度及碱性磷酸酶活性能够反映组织工程支架材料的生物相容性，可作为评价组织工程材料生物相容性的指标。
关键词 脱蛋白型松质骨 脱钙型松质骨 细胞内游离钙 碱性磷酸酶
【文献标识码】 A 【文章编号】1606-8106(2004)10-0877-03
, 百拇医药
In vitro studies on the effects of implanted materials on
introcelluar calcium and alkaline phosphatase of rat osteoblasts
Wang Lei，Lin He，Zhang Qingguo
Department of Plastic Surgery，Zhong Da Hospital，Southeast University，Nanjing210009.
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of two implant materials:decalcified bone(DB)and deproˉteinized bone(DPB)on the concentration of intracellular free calcium and alkaline phosphatase activity of rat osˉteoblasts cultured in vitro，and expose the biological compatibility of the implant materialsas well as the index to estiˉmate cytocompatibility.Methods Osteoblast was derived from calvaria of newborn SD rats，transplanted onto decalciˉfied bone and deproteinized bone after the cells were purified，After7days of co-incubation，the cells were taken out to measure alkaline phospatase activity and the intracellular calcium concentration.Results Activity of ALP and conˉcentration of intracellular free calcium of the osteoblasts co-incubated with deproteinized bone were as normal as the control，but cells cultured with decalcified bone has higher activity of ALP and concentration of intracellular free calˉcium than those of them.Conclusion Both materials have no negative effects on osteoblasts.Decalcified bone can promote the abilities of the osteoblast.Activity of ALP and concentration of intracellular free calcium can be used as indices to evaluate biologicalcompatibility condition of implant materials.
, 百拇医药
Key words deproteinized bone decalcified bone introcellular free calcium alkaline phosphatase
成骨细胞是组织工程的效应细胞，在它生长分化和基因表达过程中，细胞内游离钙(Ca 2+ )浓度和碱性磷酸酶(alkaline phospatase，ALP)活性可作为细胞分化的标志 [1] 。组织工程支架材料的细胞相容性可通过这两种物质的变化间接反映出来。本实验采用脱蛋白型松质骨(deproteinized bone，DPB)、脱钙型松质骨(decalcified bone，DB)与成骨细胞体外复合，研究不同支架材料对成骨细胞游离钙浓度和碱性磷酸酶活性的影响，来揭示两种材料的细胞相容性。
1 材料与方法
1.1 大鼠原代成骨细胞培养 采用酶消化法分离提纯成骨细胞。新生24h的乳大鼠10只(SD大鼠由东南大学医学院动物中心提供)，取颅骨洗净后剪碎成1mm 3 大小。0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化15min，弃消化液，再次加入消化液，30min后弃去。PBS漂洗两次后加入消化液，37℃消化90min后收集上清液，1000rpm离心10min收集细胞，PBS漂洗并离心两次。加入10%小牛血清以1×10 6 /ml接种于50ml培养瓶中，于37℃、5%CO 2 培养箱中培养。传至第三代时用于实验。
, 百拇医药
1.2 单纯材料制备 猪DB、DPB均切割成10mm×10mm×3mm长方体，灭菌备用。
1.3 复合材料制备 将第三代成骨细胞制成1×10 6 /ml的细胞悬液，取1ml涂布于预湿的DB、DPB上，4h后，置于6孔培养板内采用气液箱悬浮培养，每种材料复合体设置12孔，另设12孔仅注入同量的细胞，为空白对照组。4天后更换培养液，继续培养3天后，作细胞内游离钙、碱性磷酸酶活性测定。
1.4 细胞内游离钙测定
1.4.1 主要仪器及试剂 Triton X-100(Amresco公司)，EGTA(B.M公司)，Fura-2/AM(Sigma公司)。650-60型荧光分光光度计(日本日立电气株式会社)。
1.4.2 标本处理 每组随机抽取6孔，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心10min，弃上清，加入PBS漂洗，再次离心，弃上清，加入1ml PBS制成细胞悬液，细胞密度为1×10 6 /ml。
, 百拇医药
1.4.3 实验步骤 实验分三组，每组6支测试管。将细胞悬液于37℃预温5min，加入Fura-2/AM(终浓度5μmol/l)37℃恒温振荡45min，负载后的细胞以含0.2%牛血清蛋白的Hank’s漂洗两次，最后调整细胞终浓度为1×10 6 /ml，测定前细胞预先于37℃复温2～3min，于分光光度计内测定其发射光强度(F)和加入Triton X-100的最大荧光强度(Fmax)及加入EGTA的最小荧光强度(Fmin)，用公式[Ca 2+ ](nmol/L)=F-Fmin/Fmax-F计算[Ca 2+ ]。
1.5碱性磷酸酶测定
1.5.1 主要仪器及试剂 Triton X-100(Amresco公司)，磷酸对硝基苯酯二钠(p-NPP)，721分光光度计(上海)。
1.5.2 标本处理 每组随机抽取6孔，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心10min，弃上清，加入PBS漂洗，再次离心，弃上清，加入1ml PBS制成细胞悬液，细胞密度为1×10 6 /ml。
, 百拇医药
1.5.3 实验步骤 实验分3组，每组6支测试管。每支试管加入等量的1%Triton X-100孵育5min，制成细胞裂解液。取1ml细胞裂解液加入Na 2 CO 3 -NaHCO 3 (0.1mol/L)和p-NPP(9mol/L)各1ml，37℃水浴15min，立即加入2ml NaOH(0.5mol/L)终止反应，测定吸光度OD 405 ，用公式ALP含量(μ·ml -1 ·min -1 )=(OD 405 ×1000)/18.8×1/15×5测定ALP含量。
2 结果
2.1 细胞内游离钙浓度 各组中成骨细胞内游离钙浓度见表1。DPB组与空白对照组细胞内游离钙浓度差异无显著性(P>0.05)，DB组与空白对照组及DPB组差异有显著性(P<0.05)。
表1 各组中成骨细胞内游离钙浓度测定结果
, 百拇医药
注:P 0 为各组与对照组比较，P 1 为各组与DB组比较
2.2 碱性磷酸酶活性 各组中成骨细胞碱性磷酸酶活性见表2。由表2可知，DPB组与空白对照组碱性磷酸酶活性差异无显著性(P>0.05)，DB组与空白对照组及DPB组差异有显著性(P<0.05)。
表2 各组中成骨细胞碱性磷酸酶活性测定结果
注:P 0 为各组与对照组比较，P 1 为各组与DB组比较
3 讨论
成骨细胞的生长分化和基因表达经历3个阶段:(1)生长增殖期，以DNA复制、组蛋白合成为特征;(2)基质形成、成熟期，以碱性磷酸酶活性增高、I型胶原分泌为特征;(3)基质钙化期，以骨钙蛋白分泌、钙离子沉积为特征，并伴有 碱性磷酸酶活性持续升高。碱性磷酸酶能够反映成骨细胞合成I型胶原，形成骨基质的能力，是成熟成骨细胞的标志[2] 。而钙离子是细胞功能调节中的第二信使，细胞内游离钙升高激活各种钙结合蛋白，将刺激信息传递给细胞内多种酶反应系统或功能蛋白。脱钙型松质骨是一种自体降解的抗原灭活骨质，不引起免疫反应。它除了主要成分胶原外，还含有诱导新骨形成的骨形成蛋白(BMP) [3] 。实验中DB组细胞内游离钙及ALP活性升高，其机理可能如下:(1)BMP通过细胞膜上的第一信使通道系统，将DNA合成的启动信号传递给相应的靶位，进而激活包括钙调素(CaM)在内的钙结合蛋白(第二信使)，启动信号再由第二信使传递给位于细胞核内的相应转录因子，上调I型胶原基因家族转录和翻译的水平。(2)DNA拷贝数的大幅增加，导致目的基因的蛋白表达水平同步升高，I型胶原蛋白合成、分泌增多，相应在组织学中表现为基质成熟、钙化过程加快。与此同时，反映成骨细胞合成I型胶原，形成骨基质能力的ALP活性升高，可能也跟BMP上调其相应基因表达蛋白的能力有关。(3)Ca 2+ -ATP酶是一种受Ca 2+-CaM复合物激活的酶，其本质也是一种钙结合蛋白，经过BMP和(或)Ca 2+ -CaM激活以后，其转运Ca 2+ 的能力大幅度提高，因而直接导致DB实验组中细胞内游离钙水平增高，作为第二信使的钙离子激活各种钙结合蛋白，将刺激信息传递给细胞内多种酶反应系统或功能蛋白，使细胞的合成代谢增强。
, 百拇医药
脱蛋白型松质骨也是一种抗原灭活的骨质，它去除了包括BMP在内的蛋白物质。其主要成分为羟基磷灰石(hyˉdroxyapatite，HA)和胶原。Ozaw [4] 等报道羟基磷灰石对大鼠成骨细胞ALP活性有增高作用。其机理可能是羟基磷灰石的羟基发生水化反应，使HA的电荷平衡失调，钙离子游离。游离的钙离子使细胞内外钙离子浓度差升高，钙离子通道的转运增多，细胞内钙离子浓度升高，促进细胞的合成代谢，反映细胞合成能力的ALP因而增高。但本实验中未发现细胞内游离钙及ALP活性升高，原因可能在于:带负电荷的胶原在HA的羟基发生水化反应后，仍能保证磷酸钙的电荷平衡，使之不能解离，钙离子无法游离，参与细胞的生理活动。故而，细胞内游离钙浓度不升高，细胞在无外界刺激因素的作用下，进行正常的合成代谢，相应的ALP活性亦不升高。
去抗原性脱钙型松质骨良好的生物相容性已得到普遍的证实 [5] ，它对细胞内游离钙浓度和碱性磷酸酶活性的升高作用，说明此种材料具有良好的细胞相容性，是骨组织工程理想的支架材料。但它的制备要求较高，既要在制备过程中必须保证BMP存留于材料上，又要保证BMP不发生变性，这些是对材料制备技术的一大挑战。而脱蛋白型松质骨对细胞虽无不良影响，但它本身脆性大，不易剪裁，是对其应用的一大限制。这些是材料研究方面待于解决的迫切问题。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Nefussi JR，Brami G，Modrwski D.Sequential expression of bone matrix protein during rat calvaria osteoblast differentiation and bone nodule forˉmation in vitro.J Histochem Cytochem，1997，45(4):493-503.
2 Stein GS，Lian JB.Molecular mechanisms mediatng proliferation/differˉentiation interrelationship during progressive development of the osˉteoblast phenotype.Endocr Rev，1993，14(4):424-441.
, 百拇医药
3 Green E，Hinton C，Triffitt JT.The effect of decalcified bone matrix on the osteogeneic potential of bone marrow.Clin Orthop，1986，205:292-298.
4 Ozaw S，Kasugai S.Evaluation of Implant materials(hydroxyapatite， glass ceramics，titanium)In rat bone marrow stromal cell culture.Bioˉmaterials，1996，17(1):23-29.
5 Becker W，Becker BE，Caffesse R.A Comparison of deminerialized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone formation in huˉman extraction sockects.J Periodontol，1994，65:1128-1133.
作者单位:210009江苏南京东南大学附属中大医院整形外科
(编辑海 涛), http://www.100md.com
关键词 脱蛋白型松质骨 脱钙型松质骨 细胞内游离钙 碱性磷酸酶
【文献标识码】 A 【文章编号】1606-8106(2004)10-0877-03
, 百拇医药
In vitro studies on the effects of implanted materials on
introcelluar calcium and alkaline phosphatase of rat osteoblasts
Wang Lei，Lin He，Zhang Qingguo
Department of Plastic Surgery，Zhong Da Hospital，Southeast University，Nanjing210009.
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of two implant materials:decalcified bone(DB)and deproˉteinized bone(DPB)on the concentration of intracellular free calcium and alkaline phosphatase activity of rat osˉteoblasts cultured in vitro，and expose the biological compatibility of the implant materialsas well as the index to estiˉmate cytocompatibility.Methods Osteoblast was derived from calvaria of newborn SD rats，transplanted onto decalciˉfied bone and deproteinized bone after the cells were purified，After7days of co-incubation，the cells were taken out to measure alkaline phospatase activity and the intracellular calcium concentration.Results Activity of ALP and conˉcentration of intracellular free calcium of the osteoblasts co-incubated with deproteinized bone were as normal as the control，but cells cultured with decalcified bone has higher activity of ALP and concentration of intracellular free calˉcium than those of them.Conclusion Both materials have no negative effects on osteoblasts.Decalcified bone can promote the abilities of the osteoblast.Activity of ALP and concentration of intracellular free calcium can be used as indices to evaluate biologicalcompatibility condition of implant materials.
, 百拇医药
Key words deproteinized bone decalcified bone introcellular free calcium alkaline phosphatase
成骨细胞是组织工程的效应细胞，在它生长分化和基因表达过程中，细胞内游离钙(Ca 2+ )浓度和碱性磷酸酶(alkaline phospatase，ALP)活性可作为细胞分化的标志 [1] 。组织工程支架材料的细胞相容性可通过这两种物质的变化间接反映出来。本实验采用脱蛋白型松质骨(deproteinized bone，DPB)、脱钙型松质骨(decalcified bone，DB)与成骨细胞体外复合，研究不同支架材料对成骨细胞游离钙浓度和碱性磷酸酶活性的影响，来揭示两种材料的细胞相容性。
1 材料与方法
1.1 大鼠原代成骨细胞培养 采用酶消化法分离提纯成骨细胞。新生24h的乳大鼠10只(SD大鼠由东南大学医学院动物中心提供)，取颅骨洗净后剪碎成1mm 3 大小。0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化15min，弃消化液，再次加入消化液，30min后弃去。PBS漂洗两次后加入消化液，37℃消化90min后收集上清液，1000rpm离心10min收集细胞，PBS漂洗并离心两次。加入10%小牛血清以1×10 6 /ml接种于50ml培养瓶中，于37℃、5%CO 2 培养箱中培养。传至第三代时用于实验。
, 百拇医药
1.2 单纯材料制备 猪DB、DPB均切割成10mm×10mm×3mm长方体，灭菌备用。
1.3 复合材料制备 将第三代成骨细胞制成1×10 6 /ml的细胞悬液，取1ml涂布于预湿的DB、DPB上，4h后，置于6孔培养板内采用气液箱悬浮培养，每种材料复合体设置12孔，另设12孔仅注入同量的细胞，为空白对照组。4天后更换培养液，继续培养3天后，作细胞内游离钙、碱性磷酸酶活性测定。
1.4 细胞内游离钙测定
1.4.1 主要仪器及试剂 Triton X-100(Amresco公司)，EGTA(B.M公司)，Fura-2/AM(Sigma公司)。650-60型荧光分光光度计(日本日立电气株式会社)。
1.4.2 标本处理 每组随机抽取6孔，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心10min，弃上清，加入PBS漂洗，再次离心，弃上清，加入1ml PBS制成细胞悬液，细胞密度为1×10 6 /ml。
, 百拇医药
1.4.3 实验步骤 实验分三组，每组6支测试管。将细胞悬液于37℃预温5min，加入Fura-2/AM(终浓度5μmol/l)37℃恒温振荡45min，负载后的细胞以含0.2%牛血清蛋白的Hank’s漂洗两次，最后调整细胞终浓度为1×10 6 /ml，测定前细胞预先于37℃复温2～3min，于分光光度计内测定其发射光强度(F)和加入Triton X-100的最大荧光强度(Fmax)及加入EGTA的最小荧光强度(Fmin)，用公式[Ca 2+ ](nmol/L)=F-Fmin/Fmax-F计算[Ca 2+ ]。
1.5碱性磷酸酶测定
1.5.1 主要仪器及试剂 Triton X-100(Amresco公司)，磷酸对硝基苯酯二钠(p-NPP)，721分光光度计(上海)。
1.5.2 标本处理 每组随机抽取6孔，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心10min，弃上清，加入PBS漂洗，再次离心，弃上清，加入1ml PBS制成细胞悬液，细胞密度为1×10 6 /ml。
, 百拇医药
1.5.3 实验步骤 实验分3组，每组6支测试管。每支试管加入等量的1%Triton X-100孵育5min，制成细胞裂解液。取1ml细胞裂解液加入Na 2 CO 3 -NaHCO 3 (0.1mol/L)和p-NPP(9mol/L)各1ml，37℃水浴15min，立即加入2ml NaOH(0.5mol/L)终止反应，测定吸光度OD 405 ，用公式ALP含量(μ·ml -1 ·min -1 )=(OD 405 ×1000)/18.8×1/15×5测定ALP含量。
2 结果
2.1 细胞内游离钙浓度 各组中成骨细胞内游离钙浓度见表1。DPB组与空白对照组细胞内游离钙浓度差异无显著性(P>0.05)，DB组与空白对照组及DPB组差异有显著性(P<0.05)。
表1 各组中成骨细胞内游离钙浓度测定结果
, 百拇医药
注:P 0 为各组与对照组比较，P 1 为各组与DB组比较
2.2 碱性磷酸酶活性 各组中成骨细胞碱性磷酸酶活性见表2。由表2可知，DPB组与空白对照组碱性磷酸酶活性差异无显著性(P>0.05)，DB组与空白对照组及DPB组差异有显著性(P<0.05)。
表2 各组中成骨细胞碱性磷酸酶活性测定结果
注:P 0 为各组与对照组比较，P 1 为各组与DB组比较
3 讨论
成骨细胞的生长分化和基因表达经历3个阶段:(1)生长增殖期，以DNA复制、组蛋白合成为特征;(2)基质形成、成熟期，以碱性磷酸酶活性增高、I型胶原分泌为特征;(3)基质钙化期，以骨钙蛋白分泌、钙离子沉积为特征，并伴有 碱性磷酸酶活性持续升高。碱性磷酸酶能够反映成骨细胞合成I型胶原，形成骨基质的能力，是成熟成骨细胞的标志[2] 。而钙离子是细胞功能调节中的第二信使，细胞内游离钙升高激活各种钙结合蛋白，将刺激信息传递给细胞内多种酶反应系统或功能蛋白。脱钙型松质骨是一种自体降解的抗原灭活骨质，不引起免疫反应。它除了主要成分胶原外，还含有诱导新骨形成的骨形成蛋白(BMP) [3] 。实验中DB组细胞内游离钙及ALP活性升高，其机理可能如下:(1)BMP通过细胞膜上的第一信使通道系统，将DNA合成的启动信号传递给相应的靶位，进而激活包括钙调素(CaM)在内的钙结合蛋白(第二信使)，启动信号再由第二信使传递给位于细胞核内的相应转录因子，上调I型胶原基因家族转录和翻译的水平。(2)DNA拷贝数的大幅增加，导致目的基因的蛋白表达水平同步升高，I型胶原蛋白合成、分泌增多，相应在组织学中表现为基质成熟、钙化过程加快。与此同时，反映成骨细胞合成I型胶原，形成骨基质能力的ALP活性升高，可能也跟BMP上调其相应基因表达蛋白的能力有关。(3)Ca 2+ -ATP酶是一种受Ca 2+-CaM复合物激活的酶，其本质也是一种钙结合蛋白，经过BMP和(或)Ca 2+ -CaM激活以后，其转运Ca 2+ 的能力大幅度提高，因而直接导致DB实验组中细胞内游离钙水平增高，作为第二信使的钙离子激活各种钙结合蛋白，将刺激信息传递给细胞内多种酶反应系统或功能蛋白，使细胞的合成代谢增强。
, 百拇医药
脱蛋白型松质骨也是一种抗原灭活的骨质，它去除了包括BMP在内的蛋白物质。其主要成分为羟基磷灰石(hyˉdroxyapatite，HA)和胶原。Ozaw [4] 等报道羟基磷灰石对大鼠成骨细胞ALP活性有增高作用。其机理可能是羟基磷灰石的羟基发生水化反应，使HA的电荷平衡失调，钙离子游离。游离的钙离子使细胞内外钙离子浓度差升高，钙离子通道的转运增多，细胞内钙离子浓度升高，促进细胞的合成代谢，反映细胞合成能力的ALP因而增高。但本实验中未发现细胞内游离钙及ALP活性升高，原因可能在于:带负电荷的胶原在HA的羟基发生水化反应后，仍能保证磷酸钙的电荷平衡，使之不能解离，钙离子无法游离，参与细胞的生理活动。故而，细胞内游离钙浓度不升高，细胞在无外界刺激因素的作用下，进行正常的合成代谢，相应的ALP活性亦不升高。
去抗原性脱钙型松质骨良好的生物相容性已得到普遍的证实 [5] ，它对细胞内游离钙浓度和碱性磷酸酶活性的升高作用，说明此种材料具有良好的细胞相容性，是骨组织工程理想的支架材料。但它的制备要求较高，既要在制备过程中必须保证BMP存留于材料上，又要保证BMP不发生变性，这些是对材料制备技术的一大挑战。而脱蛋白型松质骨对细胞虽无不良影响，但它本身脆性大，不易剪裁，是对其应用的一大限制。这些是材料研究方面待于解决的迫切问题。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Nefussi JR，Brami G，Modrwski D.Sequential expression of bone matrix protein during rat calvaria osteoblast differentiation and bone nodule forˉmation in vitro.J Histochem Cytochem，1997，45(4):493-503.
2 Stein GS，Lian JB.Molecular mechanisms mediatng proliferation/differˉentiation interrelationship during progressive development of the osˉteoblast phenotype.Endocr Rev，1993，14(4):424-441.
, 百拇医药
3 Green E，Hinton C，Triffitt JT.The effect of decalcified bone matrix on the osteogeneic potential of bone marrow.Clin Orthop，1986，205:292-298.
4 Ozaw S，Kasugai S.Evaluation of Implant materials(hydroxyapatite， glass ceramics，titanium)In rat bone marrow stromal cell culture.Bioˉmaterials，1996，17(1):23-29.
5 Becker W，Becker BE，Caffesse R.A Comparison of deminerialized freeze-dried bone and autologous bone to induce bone formation in huˉman extraction sockects.J Periodontol，1994，65:1128-1133.
作者单位:210009江苏南京东南大学附属中大医院整形外科
(编辑海 涛), http://www.100md.com