PI3K/AKT信号通路在CTGF促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用(2)
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1.2.2 western blot法检测a-平滑肌肌动蛋白表达：采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和免疫印迹杂交法。①药物作用：以10ng/ml CTGF作用HSF 48h；②细胞总蛋白的提取：弃去药物，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS) 冲洗细胞，立即加入1×SDS 上样缓冲液(含62.5 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，2% SDS，10%甘油，50mmol/L 二硫苏糖醇，0.01%溴酚蓝)，迅速刮下细胞，冰上裂解，冰上细胞超声15～20s，离心，取上清液于-70℃保存；③ SDS-PAGE和免疫印迹杂交：各取20μl 细胞裂解提取物，95℃变性5min，上样，进行电泳、转膜、洗膜后封闭，加入小鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1∶500)，4 ℃过夜，洗膜，加入二抗室温下作用1h，洗膜后加化学发光液，X线片曝光，对蛋白条带进行吸光度(A) 值测定。内参照采用GAPDH。蛋白含量以a-平滑肌肌动蛋白和内参蛋白的平均光密度(OD)×面积(mm2)的比值来表示。
1.2.3 流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率：制备细胞悬液，收集各组细胞(细胞培养于75cm2培养瓶中)；PBS漂洗细胞两次后，离心，得到细胞沉淀；4%多聚甲醛固定30min，离心，弃上清；用0.1%皂素(内含2%BSA)通透10min，以利于抗体进入胞内，离心，弃上清；加入鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1:100)300μl，室温孵育1h；PBS洗涤两次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育30 min；PBS洗涤两次后，重悬于300μl PBS溶液中，行FCM检测。
1.3. 统计学方法：实验重复3次，结果以x±s表示，应用SPSS10.0 软件进行数据统计。组间比较应用方差分析，P
2.2 a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率：应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率 ......
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