经RNAi诱导的前脂肪细胞构建组织工程化脂肪组织(2)
1.3.3.2转染混合物制备:用无血清无双抗的DMEM稀释siRNA和转染试剂,并将后者缓慢滴加入前者,siRNA和转染试剂质量比为1:15,混合物室温孵育备用。
1.3.3.3实验分组及细胞转染:待前脂肪细胞生长至60%~70%时,换转染混合物的培养液2ml,36h后测Bax基因表达水平。
1.4 经过转染后的前脂肪细胞培养
将PLGA切成5mm×5mm×0.5mm正方形小块放入培养皿中,分别75%酒精浸泡消毒2h, 双抗浸泡过夜,无菌PBS浸洗3遍,然后置入90mm无菌培养皿中干燥,用时再紫外线照射30min。实验分2组 ,每组20个标本,Ⅰ组(实验组): 将20个标本置于24孔培养板中,滴加适量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培养箱内预湿过夜,以增加其亲水性,取1ml经酶消化的2×105/ml单细胞悬液置于PLGA海绵支架上,再加入2ml10%FBS DMEM培养液使其均匀分布;Ⅱ组(对照组):将未接种细胞的单纯支架材料滴加适量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培养箱内预湿过夜, 再加入2ml 10%FBS DMEM培养液,两组静置培养72h。
1.5 动物实验方法:20只裸鼠按实验分组,在裸鼠背部左右两侧用75%酒精消毒,于两肩胛骨处各作一0.5cm切口,潜行分离形成皮下腔隙,将体外培养的两组支架材料共40个样本,于每只鼠背部皮下植入2个复合体(左侧为I组,右侧为II组) ......
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