干扰素对腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞生物学影响的实验研究
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MTT测定法：取出96孔板，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，继续培养4h后取出，小心吸去孔内上清液，每孔加入150μlDMSO,振荡10min，使结晶物充分溶解；选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收(OD)值。
1.2.4细胞周期分析(流式细胞术)：取第6～8代生长状态良好的对数生长期细胞，消化后制成单细胞悬液，调整细胞数为1×106/ml，接种于25cm2的细胞培养瓶内，培养24h。弃原培养液，加入无血清DMEM培养液继续培养24h，进行细胞同步化处理。实验1组分别加入终浓度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFNα-2bDMEM培养液；实验2组分别加入终浓度为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000U/ml的rhIFN-γDMEM培养液；对照组加入相同容积的DMEM培养液，每组3瓶。将培养液置入37℃、5%CO2孵箱中培养48h；0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，1 000r/min离心5min，弃上清，收集细胞，70%冰乙醇固定18h，4℃保存；PI综合染液室温下避光染色30min，300目尼龙网膜过滤，流式细胞仪测细胞周期。
1.3统计学处理：实验结果用x±s表示，采用方差分析及q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 干扰素抑制腭裂术后瘢痕成纤维细胞生长增殖：MTT比色实验测定结果显示，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ培养24h后实验组于对照组OD值之间差异无统计学意义(P>0.05)，培养48h后，与对照组比较，2 000U/ml浓度组差异无统计学意义(P>0.05)，4 000、6 000、8 000、10 000U/ml浓度组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，提示rhIFNα-2b和rhIFN-γ对腭裂术后裸露骨面成纤维细胞的增殖有抑制作用(见表1、表2)。
2.2干扰素对腭裂术后瘢痕成纤维细胞的细胞周期的影响：流式细胞术测定结果显示：对照组成纤维细胞培养48h处于S-G2-M期的百分比为(44.54±3.21)%，加入rhIFNα-2b和rhIFN-γ作用48h，与对照组比较，2 000U/ml浓度组差异无统计学意义(P>0.05)；而4 000、6 000、8 000、10 000U/ml浓度组处于S-G2-M期的百分比均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)(见表3)。
3讨论
国内外研究已表明，腭裂术后硬腭部裸露骨面的形成及瘢痕修复将抑制患者上颌骨的生长，引起患者颜面部凹陷，反牙合等畸形和功能障碍。有研究表明裸露骨面的瘢痕组织，由于缺少大血管和弹力纤维，胶原纤维呈横向走行并通过沙比纤维附着于硬腭骨上，而且粘骨膜与牙周韧带相延续，因此在收缩时，对牙弓产生向内的牵张力，从而导致了面中份骨的发育不足[3]。创伤愈合是人体组织修复的一种过程，而瘢痕形成则是过度愈合或愈合紊乱。瘢痕中的成纤维细胞是创面愈合、瘢痕形成、增生和挛缩的功能性细胞，其增殖、活化、分化的异常直接导致病理性瘢痕的形成。干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等多种生物活性的细胞因子。它是目前比较明确的瘢痕增生负性调节因子[4-5]。近年来,许多体外研究表明干扰素具有抑制成胶原的合成，促进胶原降解以及激活胶原酶的活性,起到对病理性瘢痕中成纤维细胞的抑制作用[5-6]。临床上也有局部注射干扰素来治疗病理性瘢痕的报道[7-8]。然而，干扰素是否对腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞有抑制作用，之前未见报道。本实验将干扰素作用于体外培养的兔腭裂术后裸露骨面瘢痕成纤维细胞中，结果表明对细胞增殖产生明显的抑制作用。
我们为了能够将干扰素应用到预防腭裂术后的继发畸形中，于是在此首先观察了rhIFNα-2b和rhIFN-γ对体外培养的腭裂术后裸露骨面瘢痕来源的成纤维细胞的作用，以便为后续研究打下基础。本实验显示，IFN在较高浓度时对瘢痕成纤维细胞的生长增殖具有明显的抑制作用。本实验中采用MTT法检测IFN对成纤维细胞生长增殖的影响，结果发现当加入IFN48h后，4 000～10 000U/ml浓度组OD值明显低于对照组(P<0.05，P<0.01)，说明实验组的细胞比对照组细胞生长要慢，活细胞数相对较少，提示IFN对细胞增殖活性产生了抑制作用。但实验组细胞48h的OD值与24h相比仍然有所增加，说明rhIFNα-2b不能绝对抑制细胞增殖，而是抑制了细胞的增长趋势。由于MTT比色法测定反映的是细胞总数，于是我们又应用流式细胞仪测定了细胞总数中各细胞周期的百分比，反映细胞中处于分裂期的总体比例，能准确地揭示群体细胞中具有分裂能力的细胞量。结果显示加入IFN后在短时间内(24 h)与对照组无明显差别，而延长观察时间(48h) 则整体瘢痕成纤维细胞中处于S-G2-M期的比例降低(2 000 U/ml浓度组除外)。说明加入的IFN的抑制活性与细胞数量改变之间有一定的时间浓度依赖关系。我们预测：高浓度的IFN在促使瘢痕组织软化、预防和治疗瘢痕挛缩方面可以发挥作用。
本研究分析测定了IFN对瘢痕成纤维细胞的生物学效应。体外实验肯定了IFN对腭裂术后裸露骨面瘢痕的成纤维细胞的生长趋势及增殖具有显著的抑制作用。虽然其具体的作用机制目前尚未完全清楚，但为进一步进行活体实验提供了依据，也为临床上预防和治疗腭裂术后裸露骨面瘢痕形成及术后上颌骨继发畸形提供了重要的参考信息。
[参考文献]
[1]张选奋,鲁开化,李荟元,等.蛋白激酶A在转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞增殖中的作用[J].中国美容医学,2000,9(6):413-416.
[2]Gima H,Sunakawa H,Arakaki K,et al.A histological study on healing process of palate wound with bone denudation[J].J Jpn Cleft Palate Assoc,1998,23:214-225.
[3]宋庆高,石 冰,黄 旭,等.硬腭裸露对上颌骨生长发育影响的实验研究[J].华西口腔医学杂志,2004,22(1):13-15.
[4]Wu J,Ma B,Yi S,et al ......
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