应用PCR技术快速检测口腔念珠菌菌株(2)
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参见附件(1786KB，3页)。
1.2.4 DNA标化：将提取的15株念珠菌的DNA分别进行OD260和OD280检测，所得OD260/280值都在1.5～2.0。将每种念珠菌的DNA标化为DNA含量为100ng/μl，作为模板。
1.2.5 基因扩增：分别以预先提取的念珠菌基因组DNA为模板进行PCR反应。反应条件为：模板10μl，引物1μl，10×buffer(Mg2+Free)5μl，dNTP 1μl，Taq酶(5U/μl)1μl，DMSO 0.5μl，补足ddH2O至终体积为50μl。反应程序为94℃ 3min 预变性；94℃ 15s 变性，55℃ 15s 退火，72℃ 30s 延伸，30个循环；72℃5min。
1.2.6 PCR产物检测：PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后用凝胶成像系统分析。
1.2.7 测序验证：挑选相同的样本，用扩增出的单片段进行测序，测定的序列通过BLAST程序与数据库中进行比对，根据同源性比对结果，确定序列来源，用来验证改良多重PCR检测口腔念珠菌菌种的准确性。
1.2.8 统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据采用卡方检验进行统计。
2结果
2.1 培养结果如图1。
2.2基因组DNA 提取：提取的念珠菌DNA均呈无色透明状，经检测所得DNA的OD值都在1.5～2.0，表明蛋白质等杂质去除较干净，DNA纯度较高，电泳结果条带清晰、干净，无拖尾现象，说明模板的完整性好，符合分子标记所需的高质量的模板要求。
2.3不同引物对模板产物的凝胶电泳检测
2.3.1真菌通用引物②ITS4、ITS86进行扩增，扩增片断的长度均在250bp左右(如图2)。
2.3.2 念珠菌特异性引物③ITS1，ITS4；Ca1，Ca2；Ct1，Ct2进行扩增。扩增片段长度：白色念珠菌为550bp和150bp两条带，热带念珠菌为350bp，克柔念珠菌为550bp，光滑念珠菌为900bp(如图3)。
2.4培养法与PCR法结果比较
2.5 PCR检测结果的测序验证
2.5.1测序验证：挑选光滑念珠菌样本，用扩增出的单片段进行测序，测定的序列通过BLAST程序与数据库中进行比对,根据同源性比对结果，光滑念珠菌的相似率为99%(如图4)。
3讨论
念珠菌是一类条件性致病真菌，广泛定殖于人类的各种腔道内，是最常见的深部真菌感染的病原菌。正常情况下,念珠菌和宿主之间保持着平衡，在健康人群阴道、口腔、肠道中可作为良性寄生菌与宿主共存，通常并不致病。但当宿主机体免疫功能下降时，这种平衡会被破坏，这些条件致病菌可作为念珠菌性阴道炎、口腔炎、甚至胃肠炎等深部念珠菌感染的致病因素[2]。通常，念珠菌可粘附于口腔的任何部位，念珠菌感染可引起很多口腔疾病，如口腔念珠菌病、口腔白斑、义齿性口炎、鹅口疮等。念珠菌病也发生于食道中，引起疼痛和吞咽困难[3]。近年来，随着各种侵入性诊断治疗手段如手术干预、化疗、放疗或联合治疗等的广泛开展，以及各类免疫抑制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，自身免疫低下患者临床上念珠菌感染的发病率明显增高[4-5]。如何快速准确地检测念珠菌成为临床医师面临的一个重要问题。
目前，在临床上，培养是检测念珠菌的主要方法，但培养存在着耗时长，阳性率低的缺点，加之在感染早期侵袭的病原菌较少，对临床诊断念珠菌感染有较大的影响。本实验应用科玛嘉念珠菌显色培养基进行培养鉴定，培养时间为48hrs，100例口腔临床样本培养出念珠菌35株，阳性率为35%，培养时间长且阳性率较低，不能满足临床检测的要求。
随着现代分子生物学技术的不断发展，应用分子生物学手段对念珠菌进行检测成为可能，而且已成为研究的主要方向。传统的检测方法需要对样品进行分离培养，往往要花上几天乃至数周的时间，而且有些致病菌难以人工培养，给检测带来困难,而聚合酶链反应(PCR)技术的应用，克服了上述不足。与传统生物检测方法相比，PCR方法不仅检测时间短、灵敏度高，还可以检测出一些培养法不能检测的微生物种类[6]。本实验中应用引物①和②对100例样本进行PCR检测的结果分别为68株和49株，阳性率分别为68%和49%，同科玛嘉培养法的检出率35%相比，差异具有显著统计学意义(P<0.05)。同时，应用念珠菌特异性引物②还可分辨出不同的念珠菌，热带念珠菌，单一条带,大小约350bp；白色念珠菌，2条带，150bp和550bp；光滑念珠菌，单一条带，大小约900bp；克柔念珠菌,单一条带，大小约550bp[7]。通过测序验证，证明应用PCR检测念珠菌菌株的准确性高。同传统的培养方法相比较，PCR具有特异性强、敏感性高、产率高、快速、简便、重复性好，易自动化等特点。PCR 基因鉴定结果与临床培养结果一致，直接PCR 法从取样到获得凝胶电泳结果，耗时约5h，与一般临床念珠菌培养检测3～5天相比，快速、省时，有助于临床对真菌感染的早期快速诊断，且PCR方法操作简单易于掌握，有望成为临床常规使用的念珠菌诊断方法。
[参考文献]
[1]徐岩英，胡碧琼.口腔念珠菌及其致病性的研究[J].中华口腔医学杂志，1997，32(3)：180.
[2]刘植华，邓 瑛，李 晴.新生儿念珠菌感染母婴垂直传播的分子流行病学研究[J].中国临床医学，2003，10(5)：632-633.
[3]Stephens M.Understanding signs,symptoms and treatment of oral candidiasis[J].Nursing Times,2004,100(46):32-34.
[4]Shao PL,Huang LM,Hsueh PR.Invasive fungal infection-laboratory diagonsis and antifungal treatment [J] ......
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