TNF-α对体外培养的人牙囊细胞增殖特性及碱性磷酸酶的影响(2)
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1.5 TNF-α对体外培养的HDFCs的ALP的影响： 取生长良好的第5代人牙囊细胞用2.5g/l 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/l FBS 的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔103细胞接种到96孔板上，每孔体积为200μl，次日去除未贴壁死细胞，换含10ml/l FBS 的DMEM培养液，加入TNF-α浓度分别为0、5、10、25、50、100、200ng/ml，每组8孔，每3天 换液一次。于加液后5天 终止培养，其中4孔用作MTT检测细胞增殖，另4孔用pH7.4的PBS洗3遍吸干，每孔加入1ml/L Triton X-100 50μl，置4℃冰箱过夜，然后加入碱性磷酸酶底物，每孔100μl，37℃孵箱内置30min，以0.2mol/L NaOH 50μl/孔，终止反应，在酶联免疫检测仪上在410nm波长处测各孔A值，计算ALP/MTT的比值(A410/A490)间接反映细胞碱性磷酸酶活性，采用单因素方差分析进行统计学处理。
1.6 统计学分析：所有计量资料均以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，与对照组之间差异比较P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 TNF-α对体外培养的HDFCs增殖的浓度效应：TNF-α对牙囊细胞的增殖具有轻度促进作用，在10ng/ml时对牙囊细胞开始有促增殖作用，在50ng/ml时达到最高峰(P<0.05)，当浓度增大至100ng/ml时，对牙囊细胞的增殖无明显促进作用(P>0.05)(见表1)。
2.2 TNF-α对体外培养的HDFCs增殖的时间效应：选用10ng/ml的TNF-α，仅在第3天对牙囊细胞的增殖具有明显的促进作用(P<0.05)，在的5天和第7天促增值作用不明显，与对照组无明显差异(P>0.05)(见表2)
2.3 TNF-α对体外培养的HDFCs的ALP的影响：见表3，可看出，TNF-α对体外培养的HDFCs的碱性磷酸酶的表达有抑制作用，在浓度大于10ng/ml时，与对照组(浓度为0ng/ml)有显著性差异(P<0.05)。
3 讨论
细胞增殖是检测外界因素对细胞生物学效应的一个重要手段，它反映了细胞在受到外界环境因素作用后，自身发生变化的情况。TNF-α在牙齿萌出过程中具有重要作用，是调控牙齿发育和萌出的细胞因子，本实验中发现TNF-α在浓度为10～50ng/ml时具有促进HDFCs增殖的作用，在时间效应的实验中，10ng/ml的TNF-α在第三天时具有促进增殖的作用，随后5天、7天的作用并不明显，说明过高的因子浓度并不能引起相应的细胞增殖，也说明了细胞对某种因子的敏感浓度有一定的范围，超过这一范围，细胞将不敏感，甚至有毒副作用，引起细胞状态不佳甚至死亡。
TNF-α对人牙囊细胞的增殖的研究未见报道，但TNF-α在大鼠的牙囊组织中有表达[2]，且与牙齿萌出过程中的破骨细胞的形成有关，因而推测某种浓度范围内的TNF-α对牙囊细胞有促增殖作用，以往的研究也证实TNF-α可以促进成纤维细胞的增殖[3]，而牙囊细胞来源于外胚间充质，具有成纤维细胞的特性，二者的生物学特性有某些相似处。
碱性磷酸酶(ALP)是参与骨等硬组织形成、代谢、再生的重要调节物质，又是细胞分化成熟和成骨能力的标志之一， 碱性磷酸酶是与钙化组织形成密切相关的一种物质，是向成骨细胞和成牙骨质细胞分化的标志。碱性磷酸酶广泛分布于体内几乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通过水解磷酸酯、破坏矿化抑制剂及作为钙结合蛋白和磷酸基的转运子而促进矿化，作为生物矿化和成骨样细胞的特征性标记。它的表达代表骨形成状况，表明细胞分化的开始，并随细胞分化的发展而增强，其活性的高低可反映相应细胞向成骨方向转化的趋势。
本实验所采用的ALP活性检测法是利用ALP可催化对硝基苯磷酸盐水解为对硝基苯酚和磷酸盐，而产生可间接反应ALP活性的对硝基苯酚的量，与在410nm波长测得的A值呈正相关。
牙囊细胞源于外胚间充质，是具有多向分化潜能的细胞群，含有发育成牙周组织的前体细胞。Handa等[4]通过体外培养牛牙囊细胞并提取RNA进行RT-PCR检测，结果表明，细胞表达低水平的碱性磷酸酶。王浈等[5]在体外培养的人胚胎牙囊细胞中检测到碱性磷酸酶mRNA的低水平表达。张永宽[6]等用矿化液处理牙囊细胞后，ALP的活性增强，Zhao M等[7]的研究表明体外培养的永生化的鼠牙囊细胞在rhBMP-2诱导下可以向成骨细胞/成牙骨质细胞表型分化， rhBMP-2能增强骨钙蛋白、骨涎蛋白的表达，说明牙囊细胞具有向成骨样细胞分化的潜能。Morsczeck[8]等 用地塞米松和胰岛素诱导牙囊细胞向成骨样细胞分化，骨钙蛋白的表达增强，以上研究结果表明牙囊细胞具有一定的成骨特性。
TNF-α是一种炎症介质，在体内有多种生物学活性，包括诱生其它细胞因子，调节血管内皮细胞性能，诱导抗病毒活性、血管生成和成纤维细胞生长等，近年来，研究发现TNF-α能促进破骨细胞的分化，促进骨吸收[9]。在前面的文献回顾中我们提到TNF-α可抑制多种成骨因子的表达以及促进破骨因子的形成，ALP活性就是TNF-α抑制的因子之一。Nakase[10]等研究发现TNF-α可抑制成骨细胞中ALP的表达，并降低BMP-2、BMP-4引起的ALP的升高。Okabe[11]等研究发现TNF-α可降低牙髓细胞的ALP活性，并且这一作用通过NF- κB 和 Smad7信号途径进行的，这一过程可减少继发性牙本质的形成。本研究中TNF-α在大于10ng/ml时即可抑制ALP的活性(P<0.05)，说明TNF-α能抑制牙囊细胞的成骨特性，同时也说明牙囊细胞具有成骨和破骨两种特性，在不同因子的作用下，牙囊细胞可表现不同的特性，也表明在牙齿萌出、发育过程中，成骨和破骨的发生是由多种因子共同作用发生的，可能引起牙胚冠方的骨质吸收，根方的骨质增生。其时间、空间的分布是非常复杂的，也是我们需要进一步研究的方向。
4 结论
本实验采用不同浓度的TNF-α作用于体外培养的HDFCs ......
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