SLE患者骨髓间充质干细胞生物学特性的研究(1)
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【摘要】 目的 了解SLE患者骨髓间质干细胞(MSC)的生物学特性。方法 采用密度梯度离心和贴壁筛选法对9例SLE患者和5例正常人骨髓MSC进行分离培养，观察MSC形态，流式细胞术检测MSC表面分子CD29、CD44、CD34、CD45的表达及MTT法检测MSC的生长情况。 结果 SLE患者MSC传代率(55.6%)低于正常(100%)(P<0.01)，体外扩增成功的SLE患者MSC细胞形态、原代培养所需时间、平均传代时间及表面特异性分子表达均与健康对照组无明显差异。体外扩增不成功的SLE患者MSC易于自行凋亡。结论 SLE患者MSC有异质性，部分患者MSC存在生物学特性异常。
【关键词】 红斑狼疮；系统性；骨髓间充质干细胞；生物学特性
骨髓间充质干细胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潜能，并具有支持造血和免疫负调节作用[1]。大量的体外细胞培养实验[2,3]证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治疗中具有较广阔的应用前景。了解SLE患者自身MSC是否异常是判断选择自体或异体MSC移植治疗SLE的重要依据。SLE患者MSC的体外扩增及其生物学特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面。
1 资料与方法
1.1 一般资料 9例SLE患者均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准，SLE疾病活动评分(SLEDAI)判断疾病的活动程度。9例患者的资料见表1。另选5例性别、年龄匹配的健康者作为对照组。
1.2 骨髓MSC分离培养 采用羟基淀粉沉淀联合Ficoll 密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养MSC。具体方法无菌操作下抽取骨髓液 10 ml，以 5×105 U/ml 肝素钠抗凝，先用羟基淀粉按1∶4体积加入，静置20 min，通过自然沉降去除下沉的大量红细胞，剩余的含大量红细胞的下层液体，再用淋巴细胞分离FicollHypaque常规分离单个核细胞。将上述两步分离所得的骨髓单个核细胞充分混匀，悬浮于体积分数为10%的 胎牛血清DMEMLG 培养液中，按约1×106/ml密度接种于25 cm2培养瓶， 置 37 ℃、体积分数为5%的 CO2饱和湿度的培养箱中。当显微镜下观察细胞已达90%融合时，则可传代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美国)消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于完全培养液中，按104/cm2的密度接种于新的培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，每3~4天更换1次培养液，约1周待细胞生长密度达90%左右时，进行再次传代。
1.3 MTT法检测MSC的生长情况 MTT比色法检测SLE患者第2代MSC的生长情况，作传代细胞培养的生长曲线分析。
1.4 流式细胞术检测MSC表面分子的表达 细胞培养扩增到第三代时，分别取100 ul细胞悬液与鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗体室温反应30 min。流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 MSC的传代情况及形态
本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC体外培养。5例健康对照者MSC 均能成功体外扩增。9例患者中，5例MSC能传代扩增，传代率为55.6%。其中女性4例，男性1例，年龄16~26岁，平均年龄21.8岁；病程3~24月，平均病程9.8月；DAI评分为15~21， 平均评分为18.6。5例SLE患者均合并有肾损害，其中1例合并有血液系统损害。MSC体外扩增不成功的4例SLE患者，均为女性，年龄26~45岁，平均年龄38.2岁；病程6~60月，平均病程37.5月；DAI评分为1322， 平均评分为18.5。4例SLE患者均合并有肾损害，其中2例合并有严重血液系统损害。每例患者的临床资料及MSC体外培养基本情况见表1。
2.1.1 体外扩增成功者 5例MSC体外扩增成功的SLE患者，MSC生长情况与健康对照组相比较：原代培养时，细胞形态上与健康对照组相似，但纺锤形、梭形细胞的出现稍晚，一般于2~4 d，健康对照组的一般出现于1~2 d内；随后逐渐见集落形成，原代培养的时间平均为(14.2±1.45)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，细胞呈长梭形旋涡样生长；传代后细胞生长较旺盛，平均传代时间(5.8±0.44)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。消化传代的细胞于24 h内完全贴壁，形态与健康对照组相似。
2.1.2 体外扩增不成功者 MSC生长情况与健康对照组相比较：同等骨髓量分离得到的单个核细胞数量与健康对照组相比明显减少，且贴壁的纺锤形、梭形细胞的出现时间明显较晚，一般于6~7 d，且仅零星分布，不成集落生长，随着培养时间的延长，其中2例可见细胞少量扩增，培养至第15天，约见20%~30%融合的短梭形细胞生长(图3)，至第30天，细胞基本自行凋亡；另2例至第18天，见部分长梭形细胞零星分布，融合少于10%，至第30天细胞基本自行凋亡。
2.2 MSC表面分子的表达
流式细胞术检测BMMSC细胞表面抗原，结果显示体外扩增成功的SLE患者BMMSC均高表达CD29、CD44，而不表达CD34、CD45，第3代BMMSC纯度达95%以上，且各表面标志的表达与健康对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 MSC的生长情况
SLE患者第2代MSC生长趋势与健康对照组相似，第3~4天生长活跃，第4天后生长渐缓，第56进入生长平台期。
3 讨论
MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一群干细胞，体外培养易纯化、扩增迅速，具有支持造血、免疫调节和诱导免疫耐受的作用。本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC的体外培养。健康对照者MSC 均能成功体外扩增。9例SLE患者中，5例可以传代扩增，传代率为55.6%。有4例SLE患者MSC不能成功传代扩增，说明部分SLE患者MSC存在缺陷。另一方面，我们发现能成功传代的5例SLE患者MSC无论是从细胞形态、原代培养所需时间、平均传代时间及表面特异性分子表达均与健康对照组无明显差异 ......
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