来氟米特对糖尿病肾病大鼠肾脏VEGF表达的影响(2)
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1.3标本收集与肾脏病理学检查
于8、12周末,收集大鼠24 h尿液,检测尿蛋白定量,称大鼠体重,心脏采血行肌酐、尿素氮检测。取血后,解剖所有实验大鼠,分离左肾,去包膜,称重。将左肾沿纵向切开,一半放入10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,常规切片,行PAS染色,光镜观察肾组织的病理变化。
1.4免疫荧光检测肾组织VEGF蛋白的表达
切片经过常规脱蜡、水化、组织抗原修复后,滴加5%BSA封闭液,室温 20 min后滴加兔抗大鼠 VEGF多克隆抗体,室温孵育60 min,PBS液冲洗;滴加山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗(1∶200) 37℃避光孵育1 h,PBS冲洗5 min×3次震摇;中性树胶封片;全自动多功能荧光显微镜观察阳性染色发绿色荧光。每张切片随机选 30个视野,用全自动图像分析系统(Iage2 roplus 6.0)分别计数其ID值,取其平均值。
1.5 肾组织VEGF mRNA表达的检测
取另一半左侧肾脏皮质区 100 mg组织作总RNA 提取,按照 RNAROSE REAGENT说明书步骤提取肾皮质总 RNA,参照 PrimeScript, RT-PCR Kit说明书进行逆转录。PCR反应条件为: 94℃变性5 min;94℃ 60 s,58℃ 60 s,72℃ 60 s 共 38 个循环,72℃延伸10 min。引物根据文献[4],由大连宝森公司设计合成,引物序列分别为,VEGF,上游: 5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3′,下游:5′-TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG-3′;产物200 kb;β-actin,上游: 5′CTCT GGTCGTACCACTGGCATTG-3′,下游:5′-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′,产物626 kb 。取5 μl扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳图像分析系统分析各条带积分光密度值(OD),每组标本重复监测4次,以(VEGF/β-actin)×100 为VEGF mRNA 的相对值。
1.6统计学方法
所有数据均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,由 SPSS 13.0统计分析软件完成,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1一般情况观察
正常对照组大鼠基本情况良好,体重增加明显,同时精神状态良好,活动自如。36只Wistar大鼠一次性注射足量STZ后全部成模,成模大鼠多有精神萎靡症状,均出现多饮、多食、多尿、消瘦、毛发枯黄无光泽等糖尿病表现。
2.2各组大鼠8周及12周末Scr、BUN及 24 h尿蛋白的测定
8、12周末糖尿病模型大鼠(B、C、D组)的Scr、BUN及 24 h尿蛋白较正常对照组(A组)均有显著增高(P<0.01);12周末时B、C、D组大鼠的Scr、BUN及 24 h尿蛋白均较8周时有所增加。LEF干预组及氯沙坦干预组上述指标均低于B组,差异有统计学意义(P<0.01),但LEF干预组及氯沙坦干预组之间差异无统计学意义。分别见表1、2。
2.3大鼠肾脏病理组织学比较
12周末时PAS 染色见正常对照组大鼠肾小球囊腔内无渗出,肾小管结构清晰无管型;糖尿病模型组大鼠肾小球系膜区基质增多,系膜区明显扩宽,部分毛细血管塌陷,可见部分肾小管上皮细胞空泡变性、萎缩、坏死;来氟米特干预组及氯沙坦干预组上述病理改变较糖尿病模型组均有明显改善,见图1。
2.4大鼠肾皮质 VEGF蛋白表达的影响
实验结束后,每组随机不重复各取30个肾小球,测定面积密度(阳性面积/肾小球面积), 图像用高清晰度彩色病理图文分析系统进行分析,免疫荧光结果显示:正常组肾组织中VEGF有少量表达;DN模型大鼠肾组织中表达明显上调;来氟米特及氯沙坦干预组VEGF表达均下调,但来氟米特与氯沙坦干预组与糖尿病模型组相比VEGF阳性细胞数显著减少,与模型组相比差异均有统计学意义。各组12周末大鼠肾组织VEGF的病理表达见图2、3。
2.5大鼠肾脏VEGF mRNA 表达的影响
正常组肾脏组织 VEGF mRNA 表达极低,糖尿病模型组、来氟米特干预组及氯沙坦干预组大鼠肾脏组织VEGF mRNA 的表达均增高。来氟米特干预组与氯沙坦干预组与糖尿病模型组比较,VEGF mRNA 的表达显著降低(P<0.05)。大鼠肾脏VEGF mRNA 表达及测定见图4。
3讨论
DN是常见的糖尿病慢性微血管并发症之一 ,通常指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚,系膜扩张以及胞外基质增生,导致肾小球的高滤过和蛋白尿[5],早期表现为尿中排出微量清蛋白,继之出现临床蛋白尿,最后进展为慢性肾衰竭。
DN的发生、发展与血管内皮功能障碍密切相关。血管内皮生长因子(vascular endothelial grow th factor , VEGF)是一种内皮细胞特异性的丝裂原,已发现 VEGF与DN 发生发展相关[6-7]。大量研究表明糖尿病肾病早期表现为:肾小球高滤过、肾小球和肾脏增大,随后系膜基质进行性扩张、肾小球和肾小管基底膜增厚、晚期肾小球硬化、肾间质纤维化、肾衰竭很大程度上与内皮功能障碍和血管病变相关[8]。VEGF作用于肾小球毛细血管内皮细胞,促进血管生长,增加血管通透性,参与DN早期蛋白尿的形成, 促进内皮细胞增生和单核细胞迁移,增加黏附分子及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的产生,导致肾小球肥大、肾小球系膜区ECM堆积及肾小球硬化[8-10]。Flyvbjerg研究表明,长期应用VEGF抗体的2型DM大鼠,其肾脏功能得以改善,VEGF抗体治疗组在肾脏重量增加、肾小球容积增大、基底膜增厚、尿蛋白排泄增加均比安慰剂治疗组下降。由于VEGF增加血管通透性,故致某些细胞因子渗出,局部作用于肾小球系膜区,可刺激肾脏肥大,最终造成肾脏损害。本实验糖尿病大鼠有早期DN表现,且血糖、24 h 尿蛋白明显升高,证实糖尿病大鼠模型成功。本实验发现DN大鼠肾脏VEGF mRNA呈持续表达,VEGF 蛋白主要分布于肾小球上皮细胞,与既往报道一致[11]。本研究还发现在糖尿病模型组VEGF 分布范围较正常大鼠组明显增大,8、12 周在肾小管的表达明显增强 ......
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