黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化(2)
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1.4 人参皂苷Re转化产物的粗处理
将具有转化作用的真菌，分别进行液体发酵转化人参皂苷Re，转化液分别进行如下纯化过程。离心，上清液用水饱和的正丁醇分别萃取3次，合并正丁醇萃取部分，浓缩得提取物A。菌丝体用甲醇提取1次，回收甲醇得提取物B，合并A、B两部分提取物。水溶解，经HPD100型大孔吸附树脂吸附，蒸馏水洗涤去除杂质，再用95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱液，浓缩。
2 结果
2.1 活性菌株的筛选
从长白山的2年和5年人参根际土壤样品中共分离获得各种类型真菌68株，通过液体筛选方法，发现具有转化人参皂苷Re的活性菌株3株，分别记为SRS-67、SRS-68和SRS-69(图1)。其中SRS-69(黑曲霉)对人参皂苷Re有较强的转化活性，另外两株真菌菌株SRS-67和SRS-68正在鉴定中。
2.2 人参皂苷Re的转化产物的分离纯化
真菌SRS-67和SRS-68的转化浓缩液，经PTLC，重结晶纯化，分别得到单体化合物1及2。
SRS-69部分的浓缩液0.19 g，甲醇溶解，硅胶(0.5 g)拌样，进行硅胶柱色谱进行分离(15 g)，洗脱系统为CHCl3-MeOH (100∶1, 100∶2, 100∶3, 100∶4, 100:5, 100∶7, 100∶9, 100∶11， 100∶13, 0.8 L each solvent)得到3个部分(F1-F3)。F3 组分经C18硅胶柱色谱，用不同比例甲醇-水洗脱，得到两个部分F3-1和F3-2。F3-1组分继续经反向HPLC分离得到化合物3(18.2 mg)；F3-2部分反复重结晶(甲醇)得到化合物4(24.5 mg)；F2组分通过制备TLC色谱，氯仿甲醇100∶25作为展开剂，分离得到化合物5(12.9 mg)。
2.3 人参皂苷Re的转化产物的结构鉴定
SRS-67、SRS-68和黑曲霉的转化产物1-3经TLC和HNM数据分析，鉴定其为同一化合物。
化合物1-3：白色粉末(MeOH)，熔点191~194℃，1H NMR(pyridine-d5, 300 MHz)中在高场区0.83，1.04，1.17，1.59，1.60，1.64，1.62和2.07处给出8个单峰甲基信号；两个连氧质子信号5.03(1H, d，J=7.8 Hz)和5.18(1H, d, J=7.7 Hz)，归属为β-葡萄糖端基质子；以上数据和13C NMR数据与文献[18]报道的人参皂苷Rg1一致。
化合物4：白色粉末(MeOH)，熔点187~189 ℃，1H NMR(pyridine-d5，300 MHz)中在高场区0.95，0.97，1.20，1.36，1.40， 1.64，1.69和2.14处给出8个单峰甲基信号；两个连氧质子信号5.28(1H，d，J=6.8 Hz)和4.81(1H，brs)，分别归属为β-葡萄糖和α-鼠李糖端基质子；以上数据和13C NMR数据与文献[19]报道的人参皂苷Rg2一致。
化合物5：白色粉末(MeOH)，熔点168~170℃，1H NMR(pyridine-d5，300 MHz)中在高场区0.83，1.03，1.18，1.42， 1.61，1.64，1.67和2.07处给出8个单峰甲基信号；一个连氧质子信号5.03(1H，d，J=7.79 Hz)，归属为β-葡萄糖端基质子；以上数据和13C NMR数据与文献[8, 19]报道的人参皂苷Rh1一致。
3 讨论
根据转化底物和产物的结构特征推测其转化途径：真菌SRS-67和SRS-68的转化机制为产生α-鼠李糖苷水解酶，水解掉人参皂苷Re的α-鼠李糖而生成人参皂苷Rg1，如图2所示；黑曲霉将人参皂苷Re转化为 G-Rg1, G-Rg2和G-Rh1，说明黑曲霉不但产生α-鼠李糖苷酶活性，水解G-Re和G-Rg2的C-6 位O-β-葡萄糖(2→1)α-鼠李糖苷键连接，而且产生β-葡萄糖苷水解酶，该酶立体选择性水解C-20位葡萄糖，而对于C-6位葡萄糖并不起作用，因此仅产生人参皂苷Rh1而没有得到人参皂苷F1，转化过程如图2所示。这一转化途径与其他生物体系如小鼠的胃、大肠或者内生菌的转化过程不同，为首次报道。
图2 人参皂苷Re 可能的转化途径
[参考文献]
[1] Chen X, Zhou QL, Wang BX.The metabolism of ginsenoside Rbl by intestinal Bacteda [J]. Acta Pharm. Sin,1999,34(6):410-414.
[2] 庄毅.菌质——中药的一个新领域[J].中药新药与临床药理(Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology),1992,3(2):49-51 ......
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