MSRE-qPCR法检测少弱精子症患者父源印记基因H19上游区域甲基化水平(2)
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1.5 甲基化水平分析
采用标准曲线相对定量法对精液样本甲基化水平进行分析，以百分数表示甲基化水平，甲基化水平=(消化组定量结果/未消化组即对照组定量结果)×100%。标准曲线构建采用父源印记基因H19标准质粒(来源于山西医科大学法医学院)，标准质粒经梯度稀释后与精液样本同时扩增，绘制标准曲线。
1.6 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MSRE-qPCR方法评估
2.1.1 HhaⅠ酶切效率评估以H19标准质粒检测酶切效率，将50、200、400 ng的H19标准质粒以HhaⅠ消化16 h后进行MSRE-qPCR分析，同时设计未消化对照，酶切效率=[(未消化定量结果-消化定量结果)/未消化定量结果]×100%，结果HhaⅠ对50、200、400 ng的H19标准质粒的酶切效率分别为99.9%、99.9%、99.8%。
2.1.2 PCR引物扩增评估本研究所设计qPCR引物，其线性范围宽，扩增灵敏度高，扩增效率为103.9%，相关系数可达0.999，引物特异性好，在Tm=87.3℃时出现单一产物峰；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证，两对引物均扩增特异性好，条带清晰(图1)。
A B
图1PCR产物琼脂糖电泳结果
A：常规PCR扩增结果，泳道1为147 bp引物扩增基因组产物，泳道2为1700 bp左右引物扩增基因组产物，泳道3为Marker DL2000；B：qPCR扩增结果，泳道1为147 bp引物扩增基因组产物，泳道2为实验组扩增产物，泳道3为Marker DL500
2.2 样品中父源印记基因H19上游区域甲基化状态的分析
20例正常精液样本父源印记基因H19上游区域均为高甲基化状态 ......
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