Jagged 1在生理性和病理性新生血管形成中的表达变化(2)
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1 材料与方法
1.1 实验材料
人脐静脉内皮细胞株EA.HY926，由中南大学湘雅医学院细胞中心引进。种蛋购自衡阳联合养鸡公司，选用新鲜、大小适中的优质种蛋，半自动孵化箱自行孵育。在解放军169医院批准同意和告知患者家属同意后，收集解放军169医院外科手术切除的结直肠癌旁正常黏膜组织5例，结直肠癌新鲜标本15例，其中男11例，女4例；年龄28～75(平均56.9)岁；肿块直径≤3 cm患者、3 cm<肿块直径≤5 cm患者、肿块直径>5 cm患者各5例，手术切除的血管瘤旁正常皮肤组织和皮肤血管瘤新鲜标本各8例，其中男4例，女4例；年龄8～32(平均20.1)岁，所有标本均由病理组织学诊断证实。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 内皮细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养液培养于37℃、5% CO2的恒湿培养箱中。细胞呈单层生长，铺满培养瓶后传代。传代时常规吸去培养液，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，在显微镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立即倾去胰酶，加适量含血清培养液吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度用于实验。
1.2.2 鸡胚的培养及鸡胚绒毛尿囊膜模型的制备 新鲜受精鸡卵以1‰新洁尔灭清洗后放入60%相对湿度的孵育箱内孵育，呈45°夹角，有气室的一头向上，1～10 d温度设定为37.8℃，11～19 d设定为37℃，20～21 d设定为36.8℃，每天翻蛋2～3次。从鸡胚发育的第1天开始，每隔24 h剥开一批种蛋(每批5枚)，观察鸡胚绒毛尿囊膜的生长情况，直到第21天。剥制时，用眼科镊在种蛋的气室一端轻敲一个直径为0.5 cm的小洞，沿着洞的周围，用眼科镊慢慢夹掉卵壳，轻轻揭开卵壳膜，注意勿伤及血管，暴露整个尿囊膜部分。以甲醇和丙酮混合液(1︰1)室温固定15 min，剥离尿囊膜，铺在培养皿中，阴干保存。
1.2.3 免疫组织化学染色 染色方法按照链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法试剂盒说明书步骤操作。用已知阳性表达的组织做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照，结果以细胞膜和(或)胞浆出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应。
1.2.4 Western blotting 冰上称取组织100 mg，加蛋白裂解液进行蛋白抽提，应用Bradford法测定蛋白质含量。每样本取30 μg进行SDS-PAGE电泳 ......
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