上皮细胞激酶—2与层黏连蛋白5—γ—2在食管鳞癌细胞株TE13中相关性的研究(2)
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1?材料与方法
1.1?细胞株及细胞培养
人低分化食管鳞癌细胞株TE13购自上海细胞所，本研究组已成功构建EphA2shRNA质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP shRNA，稳定转染TE13细胞，获得TE13 EphA2/Neo细胞株和TE13 EphA2/shRNA细胞株。所有细胞培养于含10%胎牛血清RPMI-1640培养液中，在37℃，5%CO2及饱和湿度环境的培养箱中培养。
1.2?主要试剂
RPMI-1640培养基购自Hyclone公司，鼠抗人EphA2购自R&D公司，兔抗人laminin 5-γ-2抗体购自SantaCruz公司。ProteinA琼脂糖珠购自Millipore公司。M-MLV逆转录试剂购自Fermentas公司。
1.3?逆转录PCR(RT-PCR)检测
TE13细胞、TE13EphA2/Neo细胞和TE13 EphA2/shRNA细胞转染48 h后倒掉6孔板中的培液，每空加入1 mL的TRIZOL试剂，按照TRIZOL试剂的说明书抽提RNA。之后取1μg的RNA，按照Takara逆转录试剂盒的要求将总RNA逆转录成cDNA，逆转录条件为：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ +∞。引物设计由上海杰瑞生物工程有限公司完成，LN的引物为：上游引物5‘-TGAAGCGTAACCAGCCGACGC-3’，下游引物5‘-CACAAACAGCACGTCCGGCTCT-3’ ......
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