利心丸中防己诺林碱HPLC检测方法的建立及其评价
[摘要]目的建立利心丸中的防己诺林碱含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，以Inertsil ODS-3(5um，4.6mm×250mm)色谱柱，甲醇一乙腈一水一二乙胺(52：20：28：0.08)为流动相，检测波长：282nm，流速：1.0mL/min。结果己诺林碱在0.1617～0.9702ug的范围内线性关系良好，r=0.9996；平均加样回收率是98.50%，RSD=1.26%。结论方法操作简便，专属性强，准确度高，可用于利心丸的质量控制。
[关键词]利心丸；防己诺林碱；HPLC
[中图分类号]R284.1
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616(2017)03-57-04
利心丸(浓缩水丸)收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》第八册，(标准编号为WS3-B-32)。由貂心、地黄、防己、茯苓、牡丹皮等八味中药材制成的中药复方制剂。具有养心安神的功效，临床主要用于风湿性心脏病，心动过速，心律不齐，心力衰竭等而见心血不足等症者。关于利心丸的质量控制，原标准主要采用显微和紫外分光光度法进行鉴别，方法过于简单，无含量测定。相关文献报道主要集中在牡丹皮中丹皮酚的含量测定及对地黄、防己和牡丹皮的TLC定性鉴别。本文在相关文献的研究基础上，参照《中国药典》(2015版，一部)防己药材含量测定方法，首次对利心丸(浓缩水丸)中防己诺林碱的含量采用高效液相色谱法进行分析，并建立了完整的质量检测方法。结果表明，本方法稳定可靠、准确度高、重现性好。可通过定量检测利心丸(浓缩水丸)中防己诺林碱的含量，有效控制其产品质量。
1.仪器与试药
安捷伦1 100型高效液相色谱仪；KQ-250型台式超声波处理器(上海右一仪器有限公司)；HWS-26电热恒温水浴锅(广州沪瑞明仪器有限公司)；101A系列电热恒温鼓风干燥箱(常州华冠仪器制造有限公司)；P225D型天平(北京赛多利斯)。
防己诺林碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110793-200605)，利心丸(浓缩水丸)样品，吉林特研药业有限公司生产(批号：20141201-20141205)；利心丸阴性样品(自制)。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3(5um，4.6mm×250mm)；流动相：甲醇一乙腈一水一二乙胺(52：20：28：0.08)；检测波长：282nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样量：10uL。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取防己诺林碱对照品5.39mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成53.9ug/mL的对照品溶液，备用。
2.2.2供试品溶液的制备取利心丸(浓缩水丸)，研细，取约0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入2%盐酸甲醇溶液50mL，称定重量，回流提取30rain，放冷，再称定重量，用2%盐酸甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性对照溶液的制备取不含防己利心丸阴性样品，按照利心丸(浓缩水丸)制备工艺制成缺防己的阴性样品，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。
2.2.4专属性考察分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液阴性对照溶液(20、10、20uL)注入液相色谱仪中，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，本方法具有良好的专属性。色谱图见图1。
2.3线性关系考察
精密吸取2.2.1项下的防己诺林碱对照品3、6、9、12、15、18uL注入液相色谱仪进行测定。以防己诺林碱进样量(ug)为横坐标，峰面积为纵坐标作图，计算回归方程为：Y=824.64X-1.463，r=0.9996。结果表明：防己诺林碱进样量在0.1617～0.9702ug范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.4中间精密度试验
取同一批利心丸样品(批号：20141203)适量，共6份，精密称定，分别按照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，在同一实验室内，不同时间，由不同分析人员在不同的设备上进行6次独立测定，以测定结果的相对标准偏差反映实验方法的精密度。测定结果表明，防己诺林碱的平均含量是55.58ug，g，RSD是1.94%(n=6)，该方法中间精密度良好。
2.5重复性试验
取同一批利心丸样品(批号：20141203)6份，精密称定，分别按照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，在相同条件下，由同一分析人员在较短的间隔时间内按照“2.1”项下色谱条件进行6次独立测定，计算防己诺林碱的含量，以测定结果的相对标准偏差反映该测定方法的重复性。结果表明，样品中防己诺林碱含量为55.08ug/g，RSD为1.43%(n=6)。表明本方法重复性良好。
2.6准确度试验
精密称取利心丸样品6份(批号：20141203，防己诺林碱含量为55.08ug/g)各约0.25g，置于圆底烧瓶中，精密加入浓度为1.204ug，mL防己诺林碱对照品溶液1.0mL，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。实验结果见表1。
2.7样品含量测定
取利心丸样品各0.5g，精密称定，进行测定，计算防己诺林碱的含量，结果见表2。
2.8耐用性买验
2.8.1供试液稳定性及仪器精密度实验取同一供试品溶液(批号：20141203)适量，按2.1”项下色谱条件不同时间重复进样测定6次，以测定结果的相对标准偏差(RSD)来反映测定仪器的精密度及供试液的稳定性，结果见表3。根据上述测定结果可知，供试液在8h内稳定，且仪器精密度良好。
2.8.2柱温对测定结果的影响按供试品溶液制备方法制备样品液，按选定色谱条件分别于柱温30℃、35℃、40℃进样测定，结果表明柱温变化对分离效果及测定结果略有影响，但差异不大。
2.8.3不同品牌色谱柱按选定色谱条件分别采用三种色谱柱ZORBAX SB-Aq柱、Apollo C18柱、Inertsil ODS-3色谱柱，进样测定。结果表明，Inertsil ODS-3色谱柱分离效果最好，故选用InertsilODS-3色谱柱。
3.讨论
3.1目标成分的选择
关于利心丸的质量研究，文献报道主要集中在丹皮酚的含量测定及对地黄、防己和牡丹皮的TLC定性鉴别。本文通过系统的比较研究，首次建立防己诺林碱的含量检测方法，是对利心丸原有质量标准的必要补充，对指导制剂生产和控制产品质量具有一定的现实意义。
3.2色谱分离条件的选择
流动相的选择，2015年版中国药典防己药材中防己诺林碱的测定方法，需要用冰醋酸调节pH-值，流动相中还使用了十二烷基磺酸钠，色谱条件较复杂。有文献报道应用乙腈一甲醇一水一三乙胺作为流动相可对防己药材中的防己诺林碱进行良好的分离。本实验分别考查了甲醇一0.5%二乙胺、甲醇1%二乙胺、乙腈-0.5%二乙胺、乙腈-1%二乙胺等不同流动相及不同比例，最后确定甲醇一乙腈一水一二乙胺(52：20：28：0.08)为流动相，色谱条件比较简单，分析图谱的分离度、拖尾因子及对称性等条件均达到《药典》中的要求。本研究所建立的HPLC法可以使防己諾林碱与利心丸中的其他成分达到基线分离，分析时间短，结果准确，可靠。
3.3样品提取方法的选择
本研究对利心丸不同的提取方法，索氏提取、水浴回流法和超声提取法进行了比较，并对不同的提取时间，20、30、40min进行比较。最终优选2%盐酸甲醇溶液，加热回流提取30min，作为样品的提取方法。
本方法操作简便，专属性强，准确度高，可用于利心丸中防己诺林碱的定量分析方法，为进一步制定利心丸质量标准提供依据。, 百拇医药(白雪洁 于森 白雪媛)
[关键词]利心丸；防己诺林碱；HPLC
[中图分类号]R284.1
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616(2017)03-57-04
利心丸(浓缩水丸)收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》第八册，(标准编号为WS3-B-32)。由貂心、地黄、防己、茯苓、牡丹皮等八味中药材制成的中药复方制剂。具有养心安神的功效，临床主要用于风湿性心脏病，心动过速，心律不齐，心力衰竭等而见心血不足等症者。关于利心丸的质量控制，原标准主要采用显微和紫外分光光度法进行鉴别，方法过于简单，无含量测定。相关文献报道主要集中在牡丹皮中丹皮酚的含量测定及对地黄、防己和牡丹皮的TLC定性鉴别。本文在相关文献的研究基础上，参照《中国药典》(2015版，一部)防己药材含量测定方法，首次对利心丸(浓缩水丸)中防己诺林碱的含量采用高效液相色谱法进行分析，并建立了完整的质量检测方法。结果表明，本方法稳定可靠、准确度高、重现性好。可通过定量检测利心丸(浓缩水丸)中防己诺林碱的含量，有效控制其产品质量。
1.仪器与试药
安捷伦1 100型高效液相色谱仪；KQ-250型台式超声波处理器(上海右一仪器有限公司)；HWS-26电热恒温水浴锅(广州沪瑞明仪器有限公司)；101A系列电热恒温鼓风干燥箱(常州华冠仪器制造有限公司)；P225D型天平(北京赛多利斯)。
防己诺林碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110793-200605)，利心丸(浓缩水丸)样品，吉林特研药业有限公司生产(批号：20141201-20141205)；利心丸阴性样品(自制)。甲醇、乙腈均为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。
2.方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：Inertsil ODS-3(5um，4.6mm×250mm)；流动相：甲醇一乙腈一水一二乙胺(52：20：28：0.08)；检测波长：282nm；流速：1mL/min；柱温：25℃；进样量：10uL。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取防己诺林碱对照品5.39mg，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成53.9ug/mL的对照品溶液，备用。
2.2.2供试品溶液的制备取利心丸(浓缩水丸)，研细，取约0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入2%盐酸甲醇溶液50mL，称定重量，回流提取30rain，放冷，再称定重量，用2%盐酸甲醇溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性对照溶液的制备取不含防己利心丸阴性样品，按照利心丸(浓缩水丸)制备工艺制成缺防己的阴性样品，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。
2.2.4专属性考察分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液阴性对照溶液(20、10、20uL)注入液相色谱仪中，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，本方法具有良好的专属性。色谱图见图1。
2.3线性关系考察
精密吸取2.2.1项下的防己诺林碱对照品3、6、9、12、15、18uL注入液相色谱仪进行测定。以防己诺林碱进样量(ug)为横坐标，峰面积为纵坐标作图，计算回归方程为：Y=824.64X-1.463，r=0.9996。结果表明：防己诺林碱进样量在0.1617～0.9702ug范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.4中间精密度试验
取同一批利心丸样品(批号：20141203)适量，共6份，精密称定，分别按照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，在同一实验室内，不同时间，由不同分析人员在不同的设备上进行6次独立测定，以测定结果的相对标准偏差反映实验方法的精密度。测定结果表明，防己诺林碱的平均含量是55.58ug，g，RSD是1.94%(n=6)，该方法中间精密度良好。
2.5重复性试验
取同一批利心丸样品(批号：20141203)6份，精密称定，分别按照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，在相同条件下，由同一分析人员在较短的间隔时间内按照“2.1”项下色谱条件进行6次独立测定，计算防己诺林碱的含量，以测定结果的相对标准偏差反映该测定方法的重复性。结果表明，样品中防己诺林碱含量为55.08ug/g，RSD为1.43%(n=6)。表明本方法重复性良好。
2.6准确度试验
精密称取利心丸样品6份(批号：20141203，防己诺林碱含量为55.08ug/g)各约0.25g，置于圆底烧瓶中，精密加入浓度为1.204ug，mL防己诺林碱对照品溶液1.0mL，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。实验结果见表1。
2.7样品含量测定
取利心丸样品各0.5g，精密称定，进行测定，计算防己诺林碱的含量，结果见表2。
2.8耐用性买验
2.8.1供试液稳定性及仪器精密度实验取同一供试品溶液(批号：20141203)适量，按2.1”项下色谱条件不同时间重复进样测定6次，以测定结果的相对标准偏差(RSD)来反映测定仪器的精密度及供试液的稳定性，结果见表3。根据上述测定结果可知，供试液在8h内稳定，且仪器精密度良好。
2.8.2柱温对测定结果的影响按供试品溶液制备方法制备样品液，按选定色谱条件分别于柱温30℃、35℃、40℃进样测定，结果表明柱温变化对分离效果及测定结果略有影响，但差异不大。
2.8.3不同品牌色谱柱按选定色谱条件分别采用三种色谱柱ZORBAX SB-Aq柱、Apollo C18柱、Inertsil ODS-3色谱柱，进样测定。结果表明，Inertsil ODS-3色谱柱分离效果最好，故选用InertsilODS-3色谱柱。
3.讨论
3.1目标成分的选择
关于利心丸的质量研究，文献报道主要集中在丹皮酚的含量测定及对地黄、防己和牡丹皮的TLC定性鉴别。本文通过系统的比较研究，首次建立防己诺林碱的含量检测方法，是对利心丸原有质量标准的必要补充，对指导制剂生产和控制产品质量具有一定的现实意义。
3.2色谱分离条件的选择
流动相的选择，2015年版中国药典防己药材中防己诺林碱的测定方法，需要用冰醋酸调节pH-值，流动相中还使用了十二烷基磺酸钠，色谱条件较复杂。有文献报道应用乙腈一甲醇一水一三乙胺作为流动相可对防己药材中的防己诺林碱进行良好的分离。本实验分别考查了甲醇一0.5%二乙胺、甲醇1%二乙胺、乙腈-0.5%二乙胺、乙腈-1%二乙胺等不同流动相及不同比例，最后确定甲醇一乙腈一水一二乙胺(52：20：28：0.08)为流动相，色谱条件比较简单，分析图谱的分离度、拖尾因子及对称性等条件均达到《药典》中的要求。本研究所建立的HPLC法可以使防己諾林碱与利心丸中的其他成分达到基线分离，分析时间短，结果准确，可靠。
3.3样品提取方法的选择
本研究对利心丸不同的提取方法，索氏提取、水浴回流法和超声提取法进行了比较，并对不同的提取时间，20、30、40min进行比较。最终优选2%盐酸甲醇溶液，加热回流提取30min，作为样品的提取方法。
本方法操作简便，专属性强，准确度高，可用于利心丸中防己诺林碱的定量分析方法，为进一步制定利心丸质量标准提供依据。, 百拇医药(白雪洁 于森 白雪媛)